1. 在酵母中表达外源基因用什么质粒好
不同的质粒有不同特征，外源基因表达程度也不一样，不能一概而论。先确定你想表达的目的基因，然后选择合适的酵母质粒载体
2. 酵母表达载体pESC-Leu2d和pESC-Leu有什么区别
大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记,包括氨苄青霉素抗性（Ampr）、卡那霉素抗性（Kanr）、四环素抗性（Tetr）、链霉素抗性（Strr）和氯霉素抗性（Cmlr））等.
i）氨苄青霉素（Ampicillin,Amp）是青霉素的衍生物,通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应,杀死生长的细菌.细菌质粒Amp
r基因编码b-内酰胺酶,特异地切割氨苄青霉素的b-内酰胺环.
ii）氯霉素（chloramphenicol,Cml）通过与50S核糖体亚基结合,干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成.杀死生长的细菌.细菌抗性原理是Cml
r编码乙酰转移酶,特异地使氯霉素乙酰化而失活.
iii）卡那霉素（kanamycin,Kan）通过与70S核糖体结合,导致mRNA发生错读.杀死细菌.而Kan r
编码的氨基糖苷磷酸转移酶,对卡那霉素进行修饰,阻断其与核糖体结合作用.
iv）链霉素（Streptomycin,Str）通过与30S核糖体亚基结合,导致mRNA错译.杀死细菌.Str
r编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰,阻断其与核糖体30S亚基结合作用.
v）四环素（Tetracycline,Tet）通过于30S核糖体亚基结合,干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成.杀死生长的细菌.Tet r 编码特异性蛋白质,对细菌的膜结构进行修饰,组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内.
抗生素抗性筛选原理是：不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长.当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后,受体菌才能生长
3. 酵母整合表达一般整合在什么位置
摘要在大肠杆菌这一传统表达系统被频繁用作研究各种基因表达时，一种新型且有效的基因表达系统—甲醇酵母正逐渐引起人们的注意。此系统不仅具有高表达、高稳定、高分泌的特点，而且其宿主甲醇酵母—巴斯德毕赤酵母（Picchiapastoris）具有高密度生长的特性。因此近年来此表达系统的研究得到迅速发展，在其中表达了多种具有商业价值的外源蛋白。本文对甲醇酵母基因表达系统的特点及研究进展作一简要综述。1甲醇酵母表达系统的特点1.1宿主七十年代巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％[1]。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降解，且不对细胞产生毒害。1.2载体巴斯德毕赤酵母的载体是整合型载体。常见的表达载体有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等。图1为一个典型的巴斯德毕赤酵母表达载体。该载体包含醇氧化酶—1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5’AOX1和3’AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3’AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5’AOX1和3’AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5’AOX1启动子控制下表达。1.3表达菌株的构建与建立酿酒酵母基因工程表达系统类似，构建巴斯德毕赤酵母表达菌株的基本方法如下：(1)经典遗传学操作方法（如突变体分离、互补分析、回交和单孢分析）；(2)分子遗传学方法（如DNA转化、基因置换等。[3]）为了获得高稳定的外源蛋白表达菌株，巴斯德毕赤酵母表达载体连同外源基因通过同源重组整合至宿主染色体基因组座位上。对于图1所示的表达载体pPIC3，能以两种方式整合至染色体上。一种是在His4或5’AOX1dNA片段的单酶切位点将质粒载体切成线性，通过单交换整合进染色体（图2A、B）。另一种用BglⅡ酶切此质粒载体，释放出包含AOX1末端序列的表达盒，与宿主染色体上的AOX1基因发生一步基因置换（图2C），这样得到的表达菌株为AOX1缺陷型，它们代谢甲醇的速度明显减慢，但有时表达外源蛋白的水平却比野生型菌株高得多，尤其表现在摇瓶培养β-半乳糖苷酶[3]、转化酶(invertase)[4]和乙肝病毒表面抗原上[5]。与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。多拷贝表达菌株的获得方式有两种。一种是利用SDS-PAGE电泳[6]、免疫杂交[7]或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中[8]，而后再通过交换整合到受体染色体上。在发酵罐培养的产物选择压力下此两种方式获得的多拷贝表达菌株被证明是稳定的。1.4巴斯德毕赤酵母表达菌株的生长经同一表达载体转化后分离得到的不同转化子，其产物的表达水平不同。即使受体染色体上重组了相同数目的表达盒。转化子的表达情况也不近相同。因此，为了获得高产量的表达菌株，需要对大量的转化子进行筛选。小量摇瓶培养无疑是筛选转化子简便而有效的方法。但是由于在摇瓶培养中巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的水平往往不能准确地反映罐发酵中的表达情况，使之成为令人头痛的问题。主要原因是在摇瓶培养中，培养液的pH值无法控制，培养物通气不充分及无法控制添加碳源的最适速率。但是为了避免对每一个表达菌株进行繁琐的发酵罐培养条件的实验，仍需摸索表达菌株的摇瓶培养条件，使其产物的表达量与预期的发酵罐培养结果相近。巴斯德毕赤酵母表达菌株的培养条件包括：适宜的培养液缓冲系统及适当的发酵液pH值，以降低蛋白酶的活性；最大的通气量；添加适量的蛋白胨或酪蛋白水解物以避免产物被蛋白酶降解并为外源蛋白的合成及分泌提供氨基酸和能量。在甘油作碳源的培养液中，细胞迅速生长，菌体密度逐渐增大，但此时外源基因的表达被完全抑制。而当甘油缺失或被完全消耗时，甲醇被添加到培养液中，诱导产生外源蛋白。此阶段菌群生长迟缓，但产物表达旺盛。经研究人员的努力，多种生产外源蛋白的巴斯德毕赤酵母的分批和连续培养都有成功报道。1.5外源蛋白的分泌巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白分胞内的表达和分泌到胞外两种方式。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。当然，利用外源蛋白本身的信号序列很方便，因为基因的全部编码序列可以插入到表达载体的单个或多个克隆位点。但在许多例实验中，巴斯德毕赤酵母不能利用外源基因本身的信号序列引导分泌。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号——α交配因子引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌，如鼠表皮生长因子，产量达0.45g/L[11]。2巴斯德毕赤酵母中外源蛋白的表达随着巴斯德毕赤酵母表达系统的不断发展和日趋完善，许多具有商业价值的外源蛋白在此系统中得到了成功表达。由于其表达载体上醇氧化酶基因强启动子的作用，外源蛋白的表达量很高，如破伤风毒素蛋白的产量达12g/L。外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达分胞内表达和分泌到胞外两种方式。我们将在巴斯德毕赤酵母中表达外源蛋白的情况总结如表1。国内在巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白方面的研究近年刚刚起步。国家海洋局第三海洋所的陈丹等人[12]在此酵母中表达了鲈鱼生长激素，表达量为100mg/L。如今，美国Invitrogen公司已有该表达系统试剂盒出售，因此要利用此系统表达一个外源基因已十分方便。在国内外实验室的共同努力下，利用巴斯德毕赤酵母基因表达系统必将生产出具有商业价值的外源蛋白。参考文献[1]Couderc,R.etal.AgricBiol.chem.1980,44:2279-2289.[2]Tschopp,J.F.etal.NucleicAcidres,1987,15:3859-3876.[3]Cregg,J.M.etal.Bio/Technology,1993,11:905-910.[4]Tschopp,J.F.etal.Bio/Technology,1987,5:1305-1308.[5]Cregg,J.M.etal.Bio/Technology,1987,5:479-485.[6]Sreekrishna,K,etal.Biochemistry,1989,28:4117-4125.[7]ClareJ.J.etal.Bio/Technology,1991,9:455-460.[8]Vedvick,T.etal.J.Ind.Microbiol,1991,7:197-201.[9]Romanos,M.A.etal.Vaccine,1991,9:901-906.[10]Digan,M.E.etal.Bio/Technology,1989,7:160-164.[11]Clare,J.J.etal.Gene,1991,105:205-212.[12]陈丹等，生物化学与生物物理进展，1998，25（2）：140-143.(,Harbin,150010).--regulatedpromoters.Inthisreview,asicfeaturesoftheP..,Expressionofforeigngene
4. 哪位大神实验室有酵母PDR195载体
酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用，应用此系统可高水平表达蛋白，且具有翻译后修饰功能，故被认可为一种表达大规模蛋白的强有力的工具。
常用的酵母表达系统：
一，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达系统：
酿酒酵母(Saecharomycescerevisiae)在酿酒业和面包业的使用已有数千年的历史，被认为是GRAS(generally recognized as safe)生物，不产生毒素，已被美国FDA确认为安全性生物，但酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌
二，甲醇营养型酵母表达系统：
甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有汉森酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)，球拟酵母属(Torulopsis)等，并以毕赤酵母属(Pichia)应用最多。
甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中，大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在该基因的启动子(PAOX1)作用下，外源基因得以表达。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。
酵母表达的特点酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。
5. 什么是酵母质粒载体
酵母质粒载体都是利用酵母的2μm质粒和其染色体组分与细菌质粒pBR322构建而成的，能分别在细菌和酵母菌中进行复制，所以又称为穿梭载体。主要有以下三种：（1）附加体质粒（episomal：plasmid）：该质粒载体含有来自细菌质粒pBR322的复制起点并携带作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（emphasis：role=）。
此外还有来自酵母2μm质粒的复制起点以及一个作为酵母选择标记的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因3），这种质粒特点：既可在大肠杆菌中也可在酵母细胞中复制，当重组质粒导入酵母细胞中可进行自主复制，且具有较高拷贝数。
（2）复制质粒（replicating：plasmid）：该质粒含有来自细菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（emphasis：role=）和四环素抗性基因（emphasis：role=）。还有来自酵母染色体的自主复制序列（ARS），以及作为酵母选择标记的emphasis：role=italicURAemphasis3基因和emphasis：role=italicTRPemphasis1基因（色氨酸合成酶基因1），能在大肠杆菌或酵母细胞中复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。
（3）整合质粒（integrating：plasmid）：该质粒含有来自大肠杆菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（emphasis：role=）和四环素抗性基因（emphasis：role=）。以及来自酵母的emphasis：role=italicURAemphasis3基因，它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合到酵母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。
6. 裂殖酵母表达载体pesp-2,酵母菌珠sp-q01是否也可以用电转化
博凌科为解答：其实无论是那种类型的酵母表达，转化方法基本是一制的。版化学转化法对酵母权转化讲就不是很高，这里你可以用电转的。查一下以前别人的讨论，看看电转化方法，效率提高了，筛选的希望就大些了由于筛选表达酵母的时间比较长，两个方案同时做应该来的及的至于线性化，对于电转是要做的步骤，这是为了后面定位重组整合。
7. 酵母中的质粒是否整合到酵母染色体上怎么检测
质粒是可以单独遗传的，不需要整合到染色体才能遗传和表达。那么应该问怎么检测 已经构建好表达载体的表达情况。
8. 质粒载体，几种常用质粒载体的组成
这个问题有点笼统，粗略地说，质粒有很多种，比如说克隆载体，表达载体，还有用于RNA干扰版的载体等等，表达权载体还能分开原核表达的，酵母表达的，昆虫细胞表达的，哺乳动物细胞表达的等等。
最基本的是需要复制起点，筛选抗性基因和多克隆位点。还有些含有lacZ之类的报告基因，表达载体还需要有启动子，增强子，蛋白纯化用的tag等等。
9. 请问什么是穿梭质粒载体和表达质粒载体
穿梭质粒是指可以在多种宿主下复制。比如说通常能够在哺乳动物回，酵母或者其他细菌答复制表达的质粒，同时可以在大肠杆菌内复制。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。
表达质粒就是指带有启动子，增强子等等，使其在宿主体内不仅仅是可以复制，还能够通过转录翻印，在宿主内表达出相应蛋白的质粒
10. 常用哺乳动物过表达载体质粒有哪些
这个问题有抄点笼统，粗略地说，质粒有很多种，比如说克隆载体，表达载体，还有用于RNA干扰的载体等等，表达载体还能分开原核表达的，酵母表达的，昆虫细胞表达的，哺乳动物细胞表达的等等。最基本的是需要复制起点，筛选抗性基因和多克隆位点。还有些含有lacZ之类的报告基因，表达载体还需要有启动子，增强子，蛋白纯化用的tag等等。