1. 在酵母中表達外源基因用什麼質粒好
不同的質粒有不同特徵，外源基因表達程度也不一樣，不能一概而論。先確定你想表達的目的基因，然後選擇合適的酵母質粒載體
2. 酵母表達載體pESC-Leu2d和pESC-Leu有什麼區別
大多數質粒載體都是用抗菌素抗性標記,包括氨苄青黴素抗性（Ampr）、卡那黴素抗性（Kanr）、四環素抗性（Tetr）、鏈黴素抗性（Strr）和氯黴素抗性（Cmlr））等.
i）氨苄青黴素（Ampicillin,Amp）是青黴素的衍生物,通過干擾細菌細胞壁合成的末端反應,殺死生長的細菌.細菌質粒Amp
r基因編碼b-內醯胺酶,特異地切割氨苄青黴素的b-內醯胺環.
ii）氯黴素（chloramphenicol,Cml）通過與50S核糖體亞基結合,干擾細胞蛋白質的合成並阻止肽鍵的形成.殺死生長的細菌.細菌抗性原理是Cml
r編碼乙醯轉移酶,特異地使氯黴素乙醯化而失活.
iii）卡那黴素（kanamycin,Kan）通過與70S核糖體結合,導致mRNA發生錯讀.殺死細菌.而Kan r
編碼的氨基糖苷磷酸轉移酶,對卡那黴素進行修飾,阻斷其與核糖體結合作用.
iv）鏈黴素（Streptomycin,Str）通過與30S核糖體亞基結合,導致mRNA錯譯.殺死細菌.Str
r編碼一種氨基糖苷磷酸轉移酶對鏈黴素進行修飾,阻斷其與核糖體30S亞基結合作用.
v）四環素（Tetracycline,Tet）通過於30S核糖體亞基結合,干擾細胞蛋白質的合成並阻止肽鍵的形成.殺死生長的細菌.Tet r 編碼特異性蛋白質,對細菌的膜結構進行修飾,組止四環素通過細胞膜進入細菌細胞內.
抗生素抗性篩選原理是：不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養基（選擇培養基）中生長.當帶有抗菌素抗性基因的載體進入受體菌後,受體菌才能生長
3. 酵母整合表達一般整合在什麼位置
摘要在大腸桿菌這一傳統表達系統被頻繁用作研究各種基因表達時，一種新型且有效的基因表達系統—甲醇酵母正逐漸引起人們的注意。此系統不僅具有高表達、高穩定、高分泌的特點，而且其宿主甲醇酵母—巴斯德畢赤酵母（Picchiapastoris）具有高密度生長的特性。因此近年來此表達系統的研究得到迅速發展，在其中表達了多種具有商業價值的外源蛋白。本文對甲醇酵母基因表達系統的特點及研究進展作一簡要綜述。1甲醇酵母表達系統的特點1.1宿主七十年代巴斯德畢赤酵母曾被用於生產單細胞蛋白（SCP），有很好的發酵基礎，菌體密度可達100g/L乾重。其生長培養液的組分包括無機鹽、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉價而無毒。它能在以甲醇為唯一碳源的培養基中快速生長，其中醇氧化酶AOX——甲醇代謝途徑的關鍵酶可達細胞可溶性蛋白的30％[1]。而在葡萄糖、甘油或乙醇作為碳源的培養細胞中則檢測不到AOX。AOX的合成是在轉錄水平調控的。其基因啟動子具有明顯的調控功能，可用於調控外源基因的表達。此調控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊誘導又重機制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中處於非表達狀態，而在培養液中加入甲醇後，外源基因即被誘導表達。巴斯德畢赤酵母中存在著一種稱為微體的細胞器，其中大量合成過氧化物酶，因此也稱為過氧化物酶體。合成的蛋白質貯存於微體中，可免受蛋白酶的降解，且不對細胞產生毒害。1.2載體巴斯德畢赤酵母的載體是整合型載體。常見的表達載體有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等。圖1為一個典型的巴斯德畢赤酵母表達載體。該載體包含醇氧化酶—1（AOX1）基因的啟動子和轉錄終止子（5』AOX1和3』AOX1），它們被多克隆位點（MCS）分開，外源基因可以在此插入。此載體還包含組氨醇脫氫酶基因（HIS4）選擇標記及3』AOX1區。當整合型載體轉化受體時，它的5』AOX1和3』AOX1能與染色體上的同源基因重組，從而使整個載體連同外源基因插入到受體染色體上，外源基因在5』AOX1啟動子控制下表達。1.3表達菌株的構建與建立釀酒酵母基因工程表達系統類似，構建巴斯德畢赤酵母表達菌株的基本方法如下：(1)經典遺傳學操作方法（如突變體分離、互補分析、回交和單孢分析）；(2)分子遺傳學方法（如DNA轉化、基因置換等。[3]）為了獲得高穩定的外源蛋白表達菌株，巴斯德畢赤酵母表達載體連同外源基因通過同源重組整合至宿主染色體基因組座位上。對於圖1所示的表達載體pPIC3，能以兩種方式整合至染色體上。一種是在His4或5』AOX1dNA片段的單酶切位點將質粒載體切成線性，通過單交換整合進染色體（圖2A、B）。另一種用BglⅡ酶切此質粒載體，釋放出包含AOX1末端序列的表達盒，與宿主染色體上的AOX1基因發生一步基因置換（圖2C），這樣得到的表達菌株為AOX1缺陷型，它們代謝甲醇的速度明顯減慢，但有時表達外源蛋白的水平卻比野生型菌株高得多，尤其表現在搖瓶培養β-半乳糖苷酶[3]、轉化酶(invertase)[4]和乙肝病毒表面抗原上[5]。與自主復制的質粒型表達載體不同，整合型表達載體的拷貝數可以有很大的變化。含多拷貝外源基因的表達菌株合成蛋白的量也較多。多拷貝表達菌株的獲得方式有兩種。一種是利用SDS-PAGE電泳[6]、免疫雜交[7]或菌落點雜交方法在大量的轉化子中進行自然篩選。得到產量高的表達菌株。另一種在轉化前將多個表達盒拷貝插入到單個載體中[8]，而後再通過交換整合到受體染色體上。在發酵罐培養的產物選擇壓力下此兩種方式獲得的多拷貝表達菌株被證明是穩定的。1.4巴斯德畢赤酵母表達菌株的生長經同一表達載體轉化後分離得到的不同轉化子，其產物的表達水平不同。即使受體染色體上重組了相同數目的表達盒。轉化子的表達情況也不近相同。因此，為了獲得高產量的表達菌株，需要對大量的轉化子進行篩選。小量搖瓶培養無疑是篩選轉化子簡便而有效的方法。但是由於在搖瓶培養中巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的水平往往不能准確地反映罐發酵中的表達情況，使之成為令人頭痛的問題。主要原因是在搖瓶培養中，培養液的pH值無法控制，培養物通氣不充分及無法控制添加碳源的最適速率。但是為了避免對每一個表達菌株進行繁瑣的發酵罐培養條件的實驗，仍需摸索表達菌株的搖瓶培養條件，使其產物的表達量與預期的發酵罐培養結果相近。巴斯德畢赤酵母表達菌株的培養條件包括：適宜的培養液緩沖系統及適當的發酵液pH值，以降低蛋白酶的活性；最大的通氣量；添加適量的蛋白腖或酪蛋白水解物以避免產物被蛋白酶降解並為外源蛋白的合成及分泌提供氨基酸和能量。在甘油作碳源的培養液中，細胞迅速生長，菌體密度逐漸增大，但此時外源基因的表達被完全抑制。而當甘油缺失或被完全消耗時，甲醇被添加到培養液中，誘導產生外源蛋白。此階段菌群生長遲緩，但產物表達旺盛。經研究人員的努力，多種生產外源蛋白的巴斯德畢赤酵母的分批和連續培養都有成功報道。1.5外源蛋白的分泌巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白分胞內的表達和分泌到胞外兩種方式。畢赤酵母本身不分泌內源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引導分泌的信號序列。當然，利用外源蛋白本身的信號序列很方便，因為基因的全部編碼序列可以插入到表達載體的單個或多個克隆位點。但在許多例實驗中，巴斯德畢赤酵母不能利用外源基因本身的信號序列引導分泌。而由89個氨基酸組成的釀酒酵母的分泌信號——α交配因子引導序列已經成功地引導了幾種外源蛋白的分泌，如鼠表皮生長因子，產量達0.45g/L[11]。2巴斯德畢赤酵母中外源蛋白的表達隨著巴斯德畢赤酵母表達系統的不斷發展和日趨完善，許多具有商業價值的外源蛋白在此系統中得到了成功表達。由於其表達載體上醇氧化酶基因強啟動子的作用，外源蛋白的表達量很高，如破傷風毒素蛋白的產量達12g/L。外源蛋白在巴斯德畢赤酵母中的表達分胞內表達和分泌到胞外兩種方式。我們將在巴斯德畢赤酵母中表達外源蛋白的情況總結如表1。國內在巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白方面的研究近年剛剛起步。國家海洋局第三海洋所的陳丹等人[12]在此酵母中表達了鱸魚生長激素，表達量為100mg/L。如今，美國Invitrogen公司已有該表達系統試劑盒出售，因此要利用此系統表達一個外源基因已十分方便。在國內外實驗室的共同努力下，利用巴斯德畢赤酵母基因表達系統必將生產出具有商業價值的外源蛋白。參考文獻[1]Couderc,R.etal.AgricBiol.chem.1980,44:2279-2289.[2]Tschopp,J.F.etal.NucleicAcidres,1987,15:3859-3876.[3]Cregg,J.M.etal.Bio/Technology,1993,11:905-910.[4]Tschopp,J.F.etal.Bio/Technology,1987,5:1305-1308.[5]Cregg,J.M.etal.Bio/Technology,1987,5:479-485.[6]Sreekrishna,K,etal.Biochemistry,1989,28:4117-4125.[7]ClareJ.J.etal.Bio/Technology,1991,9:455-460.[8]Vedvick,T.etal.J.Ind.Microbiol,1991,7:197-201.[9]Romanos,M.A.etal.Vaccine,1991,9:901-906.[10]Digan,M.E.etal.Bio/Technology,1989,7:160-164.[11]Clare,J.J.etal.Gene,1991,105:205-212.[12]陳丹等，生物化學與生物物理進展，1998，25（2）：140-143.(,Harbin,150010).--regulatedpromoters.Inthisreview,asicfeaturesoftheP..,Expressionofforeigngene
4. 哪位大神實驗室有酵母PDR195載體
酵母表達系統作為一種後起的外源蛋白表達系統，由於兼具原核以及真核表達系統的優點，正在基因工程領域中得到日益廣泛的應用，應用此系統可高水平表達蛋白，且具有翻譯後修飾功能，故被認可為一種表達大規模蛋白的強有力的工具。
常用的酵母表達系統：
一，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表達系統：
釀酒酵母(Saecharomycescerevisiae)在釀酒業和麵包業的使用已有數千年的歷史，被認為是GRAS(generally recognized as safe)生物，不產生毒素，已被美國FDA確認為安全性生物，但釀酒酵母難於高密度培養，分泌效率低，幾乎不分泌分子量大於30 kD的外源蛋白質，也不能使所表達的外源蛋白質正確糖基化，而且表達蛋白質的C端往往被截短。因此，一般不用釀酒酵母做重組蛋白質表達的宿主菌
二，甲醇營養型酵母表達系統：
甲醇酵母表達系統是目前應用最廣泛的酵母表達系統。目前甲醇酵母主要有漢森酵母屬(Hansenula)，畢赤酵母屬(Pichia)，球擬酵母屬(Torulopsis)等，並以畢赤酵母屬(Pichia)應用最多。
甲醇酵母的表達載體為整合型質粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中，大部分甲醇酵母的表達載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在該基因的啟動子(PAOX1)作用下，外源基因得以表達。甲醇酵母一般先在含甘油的培養基中生長。培養至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導表達外源蛋白。這樣可以大大提高表達產量。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質其產量往往可達克級。與釀酒酵母相比其翻譯後的加工更接近哺乳動物細胞，不會發生超糖基化。
酵母表達的特點酵母是一種單細胞低等真核生物，培養條件普通，生長繁殖速度迅速，能夠耐受較高的流體靜壓，用於表達基因工程產品時，可以大規模生產，有效降低了生產成本。
5. 什麼是酵母質粒載體
酵母質粒載體都是利用酵母的2μm質粒和其染色體組分與細菌質粒pBR322構建而成的，能分別在細菌和酵母菌中進行復制，所以又稱為穿梭載體。主要有以下三種：（1）附加體質粒（episomal：plasmid）：該質粒載體含有來自細菌質粒pBR322的復制起點並攜帶作為大腸桿菌選擇標記的氨苄青黴素抗性基因（emphasis：role=）。
此外還有來自酵母2μm質粒的復制起點以及一個作為酵母選擇標記的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因3），這種質粒特點：既可在大腸桿菌中也可在酵母細胞中復制，當重組質粒導入酵母細胞中可進行自主復制，且具有較高拷貝數。
（2）復制質粒（replicating：plasmid）：該質粒含有來自細菌質粒pBR322的復制起點和作為大腸桿菌選擇標記的氨苄青黴素抗性基因（emphasis：role=）和四環素抗性基因（emphasis：role=）。還有來自酵母染色體的自主復制序列（ARS），以及作為酵母選擇標記的emphasis：role=italicURAemphasis3基因和emphasis：role=italicTRPemphasis1基因（色氨酸合成酶基因1），能在大腸桿菌或酵母細胞中復制，重組質粒導入酵母細胞中可獲得中等拷貝數的質粒。
（3）整合質粒（integrating：plasmid）：該質粒含有來自大腸桿菌質粒pBR322的復制起點和作為大腸桿菌選擇標記的氨苄青黴素抗性基因（emphasis：role=）和四環素抗性基因（emphasis：role=）。以及來自酵母的emphasis：role=italicURAemphasis3基因，它既可以作為酵母細胞的選擇標記，也可與酵母染色體DNA進行同源重組。這種質粒可在大腸桿菌中復制，但不能在酵母細胞中進行自主復制。一旦導入酵母細胞，可整合到酵母染色體上，成為染色體DNA的一個片段。
6. 裂殖酵母表達載體pesp-2,酵母菌珠sp-q01是否也可以用電轉化
博凌科為解答：其實無論是那種類型的酵母表達，轉化方法基本是一制的。版化學轉化法對酵母權轉化講就不是很高，這里你可以用電轉的。查一下以前別人的討論，看看電轉化方法，效率提高了，篩選的希望就大些了由於篩選表達酵母的時間比較長，兩個方案同時做應該來的及的至於線性化，對於電轉是要做的步驟，這是為了後面定位重組整合。
7. 酵母中的質粒是否整合到酵母染色體上怎麼檢測
質粒是可以單獨遺傳的，不需要整合到染色體才能遺傳和表達。那麼應該問怎麼檢測 已經構建好表達載體的表達情況。
8. 質粒載體，幾種常用質粒載體的組成
這個問題有點籠統，粗略地說，質粒有很多種，比如說克隆載體，表達載體，還有用於RNA干擾版的載體等等，表達權載體還能分開原核表達的，酵母表達的，昆蟲細胞表達的，哺乳動物細胞表達的等等。
最基本的是需要復制起點，篩選抗性基因和多克隆位點。還有些含有lacZ之類的報告基因，表達載體還需要有啟動子，增強子，蛋白純化用的tag等等。
9. 請問什麼是穿梭質粒載體和表達質粒載體
穿梭質粒是指可以在多種宿主下復制。比如說通常能夠在哺乳動物回，酵母或者其他細菌答復製表達的質粒，同時可以在大腸桿菌內復制。這樣利於對質粒的分子生物學操作和大量制備。
表達質粒就是指帶有啟動子，增強子等等，使其在宿主體內不僅僅是可以復制，還能夠通過轉錄翻印，在宿主內表達出相應蛋白的質粒
10. 常用哺乳動物過表達載體質粒有哪些
這個問題有抄點籠統，粗略地說，質粒有很多種，比如說克隆載體，表達載體，還有用於RNA干擾的載體等等，表達載體還能分開原核表達的，酵母表達的，昆蟲細胞表達的，哺乳動物細胞表達的等等。最基本的是需要復制起點，篩選抗性基因和多克隆位點。還有些含有lacZ之類的報告基因，表達載體還需要有啟動子，增強子，蛋白純化用的tag等等。